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兽药项目
药敏试验的步骤

由于药敏试验要求比较严格,条件比较高,仅仅在大中专院校或科研单位有条件的可以操作,一些养殖场或一些门诊难有条件进行药敏试验的操作。针对这个问题,笔者经过几年的总结和实践,逐渐总结出几套适合基层进行药敏试验的操作方法,现简单介绍如下。
一、试验步骤
1.试验材料:
1.1普通营养琼脂培养基:可去生化试剂店购买,做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基,如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。
1.2药敏试纸:购买或自制。
1.3细菌:待做药敏试验的细菌。
1.4接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯。
1.5移液器、滴头。
2.试验准备:
2.1药敏片的准备:购买或自制。
2.1.1药敏片的制备:取新华1号定性滤纸,用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中,瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅高压、15-20分钟消毒后,放在37℃温箱或烘箱中数天,使完全干燥。
2.2.2抗菌药纸片制作:在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升,并翻动纸片,使各纸片充分浸透药液,翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称,放37℃温箱内过夜,干燥后即密盖,如有条件可真空干燥。切勿受潮,置阴暗干燥处存放,有效期3-6个月。
2.2药液的制备(用于商品药的试验):按商品药使用治疗量的比例配制药液;如商品药“百病消”按其说明量治疗量0.01%饮水,可按这个比例配制药液,可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。
3.试验操作方法:
3.1药敏片法
3.1.1在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式;用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。(另可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液,用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面,涂布均匀致密)。
3.1.2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停,取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴,可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果,要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上;一般可在平皿中央贴一片,外周可等距离贴若干片(外周一般可贴七片),每种药敏片的名称要记住。
3.1.3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。
3.2牛津杯法
3.2.1在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式:用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后,找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。(另可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液,用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。)
3.2.2以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(内径6mm、外径8mm、高10mm圆形小管,管两端光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培养基上,轻轻加压,使其与培养基接触无空隙,在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。几分钟后,向各小管中滴加一定数量的各种药液,勿使其外溢。在37℃下培养8-18小时,观察结果。
3.2.3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。
3.3打孔法:该法较简单,成本低,易操作,比较适用于商品药物的检测。
3.3.1在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式:用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌,以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。找到第二点划线至平皿的1/2,依次划线,直至细菌均匀密布于平皿。(另可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液,用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面,涂布均匀致密。)
3.3.2以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米,管的两端要光滑,也可用玻璃管、瓷管),放置在培养基上打孔,将孔中的培养基用针头挑出,并以火焰封底,使培养基能充分的与平皿融合(以防药液渗漏,影响结果)。
3.3.3加样:按不同药液加样,样品加至满而不溢为止。
3.3.4将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后,观察效果。
二、结果观察:

过夜培养后形成一个抑菌圈,抑菌圈越大,说明该菌对此药敏感性越大,反之越小,若无抑菌圈,则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。
三、判定标准:
1.药敏试验的结果,应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。
2.药物敏感试验判定标准参考在9毫米以上为敏感,6-9毫米为低敏,无抑菌圈为不敏。
四、影响药敏结果的因素
1.培养基:应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时,厚度约5-6mm,一般90mm直径的培养皿,倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质。
2.细菌接种量:细菌接种量应恒定,如太多,抑菌圈变小,能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
3.药物浓度:药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果,需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
4.培养时间:一般培养温度和时间为37℃、8-18小时,有些抗菌药扩散慢如多粘菌素,可将已放好抗菌药的平板培养基,先置4℃冰箱内2-4小时,使抗菌药预扩散,然后再放37℃温箱中培养,可以推迟细菌的生长,而得到较大的抑菌圈。
五、应用
药物敏感试验后,应选择高敏药物进行治疗,也可选用两种药物协助使用,以减少耐药菌株。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径,因为我们药敏试验是药液直接和细菌接触,而在给禽用药的时候,必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果,所以在给禽用药时,高敏药物一定要配合适宜的给药方法,这样才会达到好的治疗效果。